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생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)은 Applied Biosystems에 의해 처음 상용화된 DNA 시퀀싱의 한 방법으로 시험관 DNA 복제 중에 DNA사슬을 마치는 디디옥시뉴클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입되는 것에 기반한다.
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인간 유전체 사업-게놈 프로젝트
DNA 염기서열 분석 원리
ddNTP, dNTP의 차이
DNA 염기 서열 분석 방법-합성된DNA 절편을 전기영동하여 형광 검출기를 이용하여 염기서열을 읽는 방법
Human Genome Project-Genome Project
DNA sequencing analysis principle
ddNTP, dNTP difference
Methods for analyzing DNA base sequences–The method for electrically activating synthesized DNA fragments to read base sequences using fluorescence detectors
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생어 염기서열 분석법 (Sanger sequencing method) 소개
생어 염기서열 분석법이란 1977년에 저명한 과학자 프레데릭 생어 (Frederick Sanger)가 개발한 염기서열분석법으로, 가장 오래되고 널리 상용화된 염기 …
Source: m.blog.naver.com
Date Published: 5/4/2022
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[DNA sequencing] 생어 염기서열 분석
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Date Published: 1/10/2021
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Sanger sequencing – 인코덤, 생물정보 전문위키
Sanger sequencing 원리의 핵심은 ddNTPs에 있다. ddNTP는 dNTP의 3번 탄소에 산소(oxygen)이 존재하지 않는, 즉 수산화기(-OH) 대신 수소(-H)가 결합되어 …
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[취향저격 분자진단] NGS: sequencing이란 무엇인가?(바이오 …
생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)은 시험관 DNA 복제 중에 DNA 사슬을 마무리 하는 디디옥시뉴클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입 …
Source: kiststory.tistory.com
Date Published: 2/29/2022
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차세대 시퀀싱 기법을 이용한 의학 유전체학의 발전 동향 – ksmcb
특히 생어 시퀀싱 기법(Sanger sequencing)은 지난. 30년간 실험실에서 비교적 간단하게 DNA 서열 해독을 하는. 방법으로 널리 쓰여 왔다. 생어가 1980년대에 DNA …
Source: www.ksmcb.or.kr
Date Published: 7/17/2021
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sanger sequencing > BRIC
sanger dna sequencing 실험을 하고 있는데요 ,, 앞부분과 끝부분을 잘 읽을 수 없어서 찾아보니까 신뢰할 수 없는부분 이니까 무시하라는 답변이 많네요 ,,, 이론적 …
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Date Published: 8/15/2022
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Sanger sequencing | welcome – Wix.com
Sanger sequencing 기본원리. 1977년 생거 등에 의해 개발된 염기서열 분석법으로서 1980년 생거가 두번째 노벨상을 받게된 계기다. 왼쪽 그림 상단에 나와있는 …
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Date Published: 10/19/2021
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2. Sanger sequencing의 기본원리
Sanger Sequencing 기본 원리 · DNA polymerase가 상보염기를 형성해 나가다가 ddNTP 4개 중 하나인 ddTTP가 섞여 들어가게 되면, 합성을 멈추게 된다. · 이 …
Source: nittaku.tistory.com
Date Published: 2/13/2022
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Sanger 염기서열분석 | 모세관 전기영동 – KR
차세대 염기서열분석(Next-Generation Sequencing) 확인. Applied Biosystems 유전자 분석기의 Sanger 염기서열분석은 업계 최고의 성능과 정확도를 모두 갖추고 있어 …
Source: www.thermofisher.com
Date Published: 1/12/2022
View: 6800
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- Author: 계숙샘
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- Date Published: 2019. 2. 10.
- Video Url link: https://www.youtube.com/watch?v=DnlqURAakyU
생어 염기서열 분석
생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)은 Applied Biosystems에 의해 처음 상용화된 DNA 시퀀싱의 한 방법으로 시험관 DNA 복제 중에 DNA사슬을 마치는 디디옥시뉴클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입되는 것에 기반한다. 프래드릭 생어와 동료가 1977년에 개발하여, 약 25년동안 가장 널리 쓰인 시퀀싱 방법이다. 최근에는, 많은 양의 생어 염기서열 분석은 특히 대규모, 자동 게놈 분석을 위해 “NGS” 방법으로 대체되고 있다. 그러나, 생어의 방법은 더 작은 규모의 프로젝트와 NGS 결과의 검증, 긴 연속 DNA 염기서열 분석 (> 500 뉴클레오티드)을 위하여 아직 널리 쓰이고 있다.
DNA 시퀀싱의 생어(사슬 종료)의 방법
방법 [ 편집 ]
고전적인 사슬 종료 방법은 하나의 단일 나선 DNA 주형, 하나의 DNA 시발체(primer), DNA 중합효소, 보통의 디옥시뉴클레오시드3인산염 (dNTP), 수정된 디-디옥시뉴클레오시드3인산염(ddNTP), DNA 나선연장을 종료하는 ddNTP가 필요하다. 이런 사슬 종료 뉴클레오티드는 인산이에스테르 결합 형성에 필요한 3′-OH가 없어 수정된 ddNTP가 삽입되었을 때 DNA 중합효소가 DNA 연장하는 것을 중단하도록 한다. ddNTP는 방사성이나 형광으로 표지되어 자동 시퀀싱 기계에서 감지된다.
DNA 샘플은 네 가지 분리된 시퀀싱 반응을 위한 샘플로 나뉘어 네 가지 표준 디옥시뉴클레오티드 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 와 DNA 중합효소를 포함한다. 각 반응에 오직 넷 중 하나의 디디옥시뉴클레오티드 (ddATP,ddGTP,ddCTP,또는 ddTTP)가 추가되고, 나머지 추가할 뉴클레오티드는 보통의 것들이다. 이 디디옥시뉴클레오티드는 상응하는 디뉴클레오티드보다 약 100배 적은 농도로 추가되어(e.g. 0/005mM ddATP : 0.5mM dATP) 전체 염기서열이 계속 복제되는 동안 충분한 조각이 만들어지도록 한다.[1] 이것을 더 실용적으로 정돈하여, 네 가지 분리된 샘플에서 모든 네 가지 ddNTP를 시험하기 위해 이 과정이 필요하다. 시발체에서의 주형 DNA 연장이 여러 차례 이루어지면, 생기는 DNA 조각은 열변성되고 겔 전기 영동을 사용해서 크기별로 분리된다. 1977년의 원본 발표에서는 ssDNA의 염기쌍 고리 형성이 같은 위치를 의 란하게 하였다. 이것은 변성된 polyacrylamide-urea gel에서 각 4개의 샘플이 하나의 개별 레인에서 처리될 때 자주 일어났다. DNA 띠들은 방사능 촬영이나 UV로 보여지게 되고 DNA 염기서열은 X-ray 필름이나 겔 이미지에서 바로 읽어질 수 있다.
방사성 표지된 시퀀싱 겔의 일부. 어두운 띠가 보인다.
오른쪽 사진에서 X-ray 필름이 겔에 노출되고 어두운 띠는 다양한 길이의 DNA 조각에 상응한다. 한 레인의 어두운 띠는 디디옥시뉴클레오티드(ddATP,ddGTP,ddCTP,또는 ddTTP)의 삽입에 따른 사슬 종료의 결과인 DNA 조각을 나타낸다. 네 레인의 다양한 띠의 상대적인 위치는 아래에서 위로 DNA 염기서열을 읽는 데에 사용된다.
표지된 dNTP 또는 표지된 ddNTP의 새 DNA 나선에서 DNA 조각은 시발체(1)에 방사성이나 형광으로 표지된다.
생어 염기서열 분석법 (Sanger sequencing method) 소개
안녕하세요. 세니젠입니다!
오늘은 DNA 염기서열 분석법의 하나인 생어 염기서열 분석법 에 대해 말씀드리겠습니다!
생어 염기서열 분석법이란 1977년에 저명한 과학자 프레데릭 생어 (Frederick Sanger)가 개발한 염기서열분석법으로, 가장 오래되고 널리 상용화된 염기서열분석법 중 하나로 꼽힙니다.
생어 염기서열 분석법은 실험의 특징에 따라 Chain termination method, 또는 최근 상용화된 차세대염기서열분석법 (Next-Generation Sequencing, NGS)과 대비하여 고전적 염기서열분석법 (Conventional sequencing method) 이라고도 불린답니다.
1. DNA의 합성 원리
생어 염기서열 분석법을 이해하기 위해서는 먼저 DNA의 합성 과정을 이해할 필요가 있습니다. ^^
DNA, 즉 디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid)를 합성하는데 쓰이는 재료를 디옥시뉴클레오시드 삼인산 (deoxynucleoside triphosphate), 줄여서 dNTP라고 부릅니다.
dNTP는 디옥시리보오스 (deoxyribose) 와 삼인산기 (triphosphate group) , 그리고 4 종류의 염기 로 이루어진 분자 구조를 갖고 있으며, 갖고있는 염기의 종류에 따라 dATP (아데닌), dGTP (구아닌), dCTP (시토신), dTTP (티민)으로 다시 분류 할 수 있습니다.
dNTP를 이루는 구성 물질 중 디옥시리보오스는 5개의 탄소로 이루어진 5탄당으로, 각각의 탄소에 1번부터 5번까지 번호를 붙여 표현 할 수 있답니다.
그리고 dNTP는 이러한 디옥시리보오스의 1번 탄소에 염기가, 5번 탄소에 삼인산기가 결합 하여 만들어집니다. (아래 그림을 참고해주세요.)
DNA의 합성에서 중요한 역할을 하는 것은 3번 위치에 있는 하이드록시기 (hydroxyl group, -OH)와 5번 위치에 존재하는 삼인산기 입니다. 이 두 작용기는 간략히 3′-하이드록시기, 5′-인산기 라고도 부릅니다.
이 두 작용기는 갖고있는 에너지가 매우 커 주변의 다른 분자들과 반응하려는 반응성이 높습니다. 이러한 높은 반응성으로 인해 동일한 dNTP가 계속해서 추가적으로 결합하는 것이죠.
일반적으로 DNA는 3′-하이드록시기에 5′-인산기가 결합 하여 만들어집니다. 그리고 이 과정에서 5′ 위치의 삼인산기는 2개의 인산기를 잃고 1인산기 (monophosphate group)가 됩니다.
반응성이 높은 두 작용기가 서로 결합하여 에너지가 낮은 안정한 상태로 되려는 성질을 이용하는 것이죠.
또한 이러한 이유로 인해 DNA는 디옥시리보오스의 탄소 번호를 기준으로 항상 5번 탄소에서 3번 탄소방향으로만 합성이 일어납니다.
출처 : http://academic.pgcc.edu/~kroberts/Lecture/Chapter%207/replication.html
2. 생어 염기서열 분석법
프레데릭 생어는 1970년대에 이러한 DNA의 합성 과정을 교묘히(?) 이용해 새로운 방식으로 염기서열을 분석하고자 했습니다.
DNA 분자가 합성되는 과정에서, 각 단계별로 사용된 dNTP의 종류를 판별할 수 있다면 결과적으로 염기서열 분석을 할 수 있게 됩니다.
예를 들어, DNA가 합성될 때, 순서대로 dATP, dATP, dTTP, dGTP가 사용되었다면, 그 DNA 분자의 염기서열은 “AATG”가 될 것입니다.
문제는 DNA의 합성을 각 dNTP가 사용되는 순간순간에 멈출 방법이 필요했다는 것이죠. DNA의 합성 속도는 매우 빨라서, 우리가 직접 어떤 dNTP가 사용되었는지 관찰할 방법이 없었습니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 생어는 디디옥시뉴클레오시드 삼인산 (dideoxynucleoside triphosphate), 줄여서 ddNTP 라는 물질을 사용하게 됩니다.
ddNTP는 dNTP와 달리 3번 탄소에 하이드록시기가 없습니다. 이로 인해 5′-인산기와 반응하는것이 불가능 하고, 따라서 DNA 중합효소가 ddNTP를 만나게 된다면 더이상의 합성이 불가능해집니다. 즉, 연쇄반응이 정지되어버리는 것이죠. (chain termination)
출처 : https://www.mun.ca/biology/scarr/Gr12-21.html
당연히 DNA 합성 과정에 ddNTP만을 넣어주게 되면 DNA는 합성이 되지 않을 것입니다.
하지만 DNA와 dNTP, 그리고 소량의 ddNTP를 같이 섞어주게 되면 어떻게 될까요?
어떤 DNA 분자는 dNTP와 결합하여 계속 길이가 길어질 것이고, 어떤 DNA 분자는 ddNTP를 만나 반응이 정지되어버릴 것입니다.
결국 똑같은 DNA를 주형삼아 합성을 시작하더라도, 그 결과 합성된 DNA의 길이는 모두 다르게 되겠죠?
예를 들어, 주형 DNA와 다수의 dNTP, 그리고 소량의 ddGTP 넣어주게 된다면 아래 그림과 같이 G가 합성되는 부분에서 일부 DNA는 연쇄반응 정지가 일어나게 되고, 길이가 다른 다수의 DNA 가닥이 만들어지게 됩니다.
이러한 현상을 이용해, 생어는 하나의 DNA 주형을 이용해 4종류의 각기 다른 ddNTP를 이용해 반응을 시킨 후, 이를 각각 젤 전기영동 하여 만들어진 DNA 가닥의 크기를 보았습니다.
이렇게 DNA 가닥을 크기별로 구분하면 결과적으로 DNA의 염기서열을 알 수 있게 됩니다.
출처 : https://www.eemec.med.ed.ac.uk/wiki/wikinode.asp?id=11068&wiki=997
다만 이런 방법으로 염기서열 분석을 진행하려면 네 종류의 ddNTP를 이용해 각각 반응을 진행해야 한다는 불편함이 있습니다.
이러한 불편함을 극복하기 위한 기술 개량이 지속적으로 이루어졌습니다.
그 결과 현대에는 네 종류의 ddNTP에 각각 다른 방사능 표지 를 부착하여 한번에 DNA 합성을 진행하고, 이를 전기영동하면서 감지기로 각 방사능 표지를 감지, 한 번의 반응으로 한 DNA 가닥의 염기서열을 분석 할 수 있게 되었습니다.
또한 한번에 대량의 DNA 분자를 분석할 수 있도록 최근에는 완전 자동화 된 기계가 널리 보급되어 쓰이고 있답니다.
출처 : https://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing
3. 이용과 한계
생어 염기서열 분석법은 오랫동안 검증되어 기술적 신뢰도가 높고 , 대량으로 보급되어 이용하기 편리 하다는 장점이 있습니다.
또한 대량의 반응을 한번에 진행할 수 있는 자동화 시스템 이 갖추어져 있고, 분석 방법이 비교적 간단하기 때문에 분석 결과를 얻는데 걸리는 시간도 매우 짧습니다.
따라서 유전자 레벨의 짧은 염기서열을 분석할 경우, 생어 염기서열분석법이 가장 좋은 선택지 가 될 수 있습니다.
하지만 도입된지 수십년 된 기술인만큼 한계점도 명확합니다.
우선 생어 염기서열 분석은 비쌉니다.
무슨 소리냐구요? ^^;;
물론 개별 반응의 비용은 생어 분석법이 훨씬 저렴합니다. 생어 분석법은 1회 반응에 몇 천원이 채 들지 않지만, 차세대염기서열분석법 (NGS)은 1회 반응에 수십만원에서 수백만원의 비용이 들어갑니다.
하지만, 결과로 나오는 염기서열 길이당 비용 을 따지기 시작하면 이야기가 달라집니다.
2012년 자료를 기준으로, 생어 분석법은 1백만 염기서열을 분석하는데 약 2,400 달러, 우리 돈으로 약 260만원이 필요합니다. (2017년 12월 환율 기준)
반면, NGS 중 하나인 Illumina sequencing은 약 0.1달러, 100원 밖에 들지 않습니다.
염기서열당 비용은 생어 염기서열 분석법이 약 24,000배 비싼 셈 이죠. 더욱이 NGS는 앞으로도 기술 향상 및 상용화로 인한 비용 저하가 예상되고 있으므로 그 차이는 더 벌어질 것입니다.
따라서 유전체와 같은 거대한 DNA 분자의 염기서열 분석을 진행하기 위해서 생어 분석법은 좋은 방법이 아닙니다.
또한 생어 분석법에서는 DNA 가닥의 앞부분 약 15~40 bp, 앞에서부터 약 1kb 이후는 잘 읽을 수 없습니다. 전기영동에 따른 size range가 정해져있고, DNA 말단 부분에서는 polymerase binding 효율이 떨어지는 등 여러 문제가 있기 때문입니다.
따라서 생어 염기서열분석법을 사용하기 이전에 이러한 부분을 충분히 숙지하여야 할 것입니다.
이상으로 생어 염기서열 분석법의 원리와 그 이용에 대해 간략히 알아보았습니다.
다음 시간에는 이러한 생어 염기서열 분석법의 한계를 극복하기 위해 등장한, 차세대 염기서열 분석법에 대해 포스팅하도록 하겠습니다.
궁금하신 점이 있으시면 언제든지! 문의 부탁드립니다~ ^^
감사합니다!
[DNA sequencing] 생어 염기서열 분석
[DNA sequencing] 생어 염기서열 분석 StartBioinformaticsAndMe
Sanger sequencing
: Sanger sequencing은 영국 생화학자 Fred Sanger(프레드 생어)와 그의 동료들이 1977년에 개발한 DNA 시퀀싱 방법
: 시험관 DNA 복제 중에 DNA 사슬을 종결시키는 ‘dideoxynucleotide termination method’에 기반
: 휴먼게놈프로젝트에서 상대적으로 작은 DNA 조각들을 시퀀싱하기 위해 사용됨
: 최근, NGS 분석으로 많이 대체 되었지만, 여전히 500bp 이상의 긴 염기서열 분석을 위해, cloning, PCR 분야 등에서 생어 시퀀싱 이용
Sanger sequencing 구성 요소
ㄱ) DNA template
→ 시퀀싱 될 DNA 주형
ㄴ) DNA 중합 효소(DNA polymerase enzyme)
→ DNA를 합성하며 연장해나감
ㄷ) 프라이머(Primer)
→ 방사성 표지 프라이머를 제작해, DNA Polymerase의 ‘스타터’로서 역할
ㄹ) 4개의 Deoxynucleotides(dNTP)
→ dATP, dTTP, dCTP, dGTP
ㅁ) 4개의 Dideoxynucleotides(ddNTP)
→ ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP
→ ddNTP가 끼어들 때 복제를 멈추며, 다양한 길이의 DNA 가닥들이 합성됨
# 생어 시퀀싱 실험 영상
#Reference
1) https://www.khanacademy.org/science/high-school-biology/hs-molecular-genetics/hs-biotechnology/a/dna-sequencing
2) https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/ngs-vs-sanger-sequencing.html
3) https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%83%9D%EC%96%B4_%EC%97%BC%EA%B8%B0%EC%84%9C%EC%97%B4_%EB%B6%84%EC%84%9D
4) https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ
5) https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=5141512&cid=60266&categoryId=60266
[DNA sequencing] 생어 염기서열 분석 EndBioinformaticsAndMe
Sanger sequencing
Structured data Category Biology
Sanger sequencing #
Sanger sequencing은 1977년에 Frederick Sanger에 의해 개발된 방법으로, 기본적으로 polymerase chain reaction (PCR) 과정에서 di-deoxynucleotide triphosphates (ddNTPs)에 의해 DNA strand가 합성되지 않는 chain termination의 원리와, 전기영동의 원리를 이용하여 염기서열을 확인하는 방법이다.
Sanger sequencing 원리 #
Sanger sequencing을 이해하기 위해서는 우선적으로 PCR 과정 대해 이해할 필요가 있다. DNA 서열 증폭을 위해서는 DNA를 구성하는 기본 단위인 deoxynucleotide triphosphate (dNTP)가 필요하다. DNA 서열에 dNTP가 중합될 때, DNA 서열 마지막 nucleotide 3번 탄소의 수산화기(-OH)와 새로운 dNTP 5번 탄소의 인산기가 반응하여 결합된다. Sanger sequencing 원리의 핵심은 ddNTPs에 있다. ddNTP는 dNTP의 3번 탄소에 산소(oxygen)이 존재하지 않는, 즉 수산화기(-OH) 대신 수소(-H)가 결합되어 있는 nucleotide 구조이다.
Fig1. ddNTP 구조
그림출처 : http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/01licohen/sequencing.html
Sanger sequencing을 진행할 때는 dNTP에 추가적으로 소량의 ddNTP가 포함된 PCR을 우선 진행한다. 이 때, 4 가지의 ddNTP (핵산별로 ddATP (아데닌), ddGTP (구아닌), ddTTP (티민), ddCTP (사이토신))는 서로 다른 형광물질로 염색되어 있다. PCR 과정에서 DNA가 증폭되던 중 우연히 dNTP 대신 ddNTP가 결합된 경우, ddNTP의 3번 탄소에는 수산화기가 없으므로 더 이상 새로운 인산기가 결합될 수 없어 증폭이 중지된다 (chain termination). ddNTP의 결합은 무작위적으로 일어나게 되므로, 수 많은 증폭과정을 통해 거의 모든 염기서열 위치에서 chain termination이 일어나게 된다.
1차적으로 ddNTP를 포함한 PCR이 완료된 후에는, 염기서열을 크기에 따라 작은 순서대로 정렬할 수 있는 전기영동을 이용하여 증폭된 서열을 정렬한다. 크기순으로 정렬된 서열의 순서대로 형광 신호를 인식시키면, 염기서열 순서대로 해당 염기 서열에 해당하는 핵산 정보가 각 서열 끝에 마지막으로 결합된 ddNTP가 가지고 있던 형광물질 종류에 따라 읽히게 된다.
Fig2. Sanger sequencing 원리
그림출처 : http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.piopio.school.nz/molmed.htm
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[취향저격 분자진단] NGS: sequencing이란 무엇인가?(바이오마이크로시스템연구단 김미연 기자)
NGS: sequencing이란 무엇인가?
최근 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing: NGS) 기술의 발달과 분석 비용의 하락으로 인해 질병 원인 유전자 분석 연구 외의 다양한 연구 분야에서 NGS가 보편적으로 활용되고 있으며, 의료계 및 산업계에서도 활발하게 사용되어지고 있다. 차세대 염기서열 분석법 이전, 사람의 몸을 구성하고 있는 DNA 서열을 모두 알고자 했던 과학자들은 DNA sequencing 기술을 연구했다. DNA sequencing 기술은 생화학적 방법으로 생명체의 모든 세포의 DNA 사슬을 구성하는 염기 A, T, G, C가 결합된 서열 순서를 분석하는 기술이다. 가장 원초적인 방법으로 Maxam-Gilbert법과 효소적인 방법인 Sanger법이 있다.
Maxam-Gilbert
출처 : https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/maxam-gilbert
Sanger sequencing이 나오기 전 Maxam과 Gilbert가 DNA 염기서열을 분석해내는 기술을 만들어냈다. 이중나선으로 꼬여 있는 DNA를 준비 한 뒤, 온도를 높여 denaturation(변성) 과정을 통해 단일 가닥의 DNA 가닥을 생성하고 5번 말단을 감마-32P를 사용하여 방사성 동위원소의 labelling을 시킨다. 그리고 화학적 반응을 이용해서 DNA 가닥을 특정 염기에서 분해시킨다. 예를 들어 dimethyl sulphate(디메틸 황산)는 선택적으로 purine계열의 A,G 염기를 공격하고 hydrazine(하이드라진)은 선택적으로 pyrimidine계열의 C,T를 공격한다. 그럼 이러한 화학적 시행을 통해서 G, A+G, C 그리고 C+T의 말단을 갖는 DNA가닥이 나눠지게 된다.
여기서 잠깐, DNA sequence를 구성하고 있는 염기 A,G,C,T 4가지 중 A,G는 퓨린계 염기, C,T는 피리미딘염기이다. A+G는 DNA 염기서열에서 A가 있는 염기에서 DNA를 자르는데, 가끔은 G point 에서도 잘리는 것을 말한다.
서로 다른 4개의 reaction tube(반응관)에 다른 사이즈의 DNA 가닥을 놓고 고해상도 acrylamide gel(아크릴아미드 겔)을 이용하여 전기영동으로 가닥을 크기별로 분리하고 X-ray 필름을 gel 위에 둬서 방사선을 쏘이면 특정 band들이 보이게 되는데 이곳이 감마-32P로 label되어진 DNA 분자의 위치이다. Sequence는 gel의 밑 부분부터 읽기 시작하며, 4개의 화학 반응의 band pattern을 읽을 때, 예를 들어 G-reaction과 G+A-reaction lane에서 모두 band가 나타났다면 이것은 G 로 읽어야 하고, 만약 G+A-reaction lane에서만 band가 나타났다면 A로 읽어야 한다.
Sanger sequencing
생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)은 시험관 DNA 복제 중에 DNA 사슬을 마무리 하는 디디옥시뉴클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입된다는 원리에 기반한다. 최근에는 많은 양의 생어 염기서열 분석을 대규모로 자동 게놈 분석을 위해 NGS 방법이 진행되고 있으나, 더 작은 규모의 프로젝트와 NGS 결과의 검증, 길이가 긴 연속 DNA 염기서열 분석 (> 500 뉴클레오티드)을 위하여 아직까지 널리 쓰이고 있다. Sanger sequencing은 고전적인 ‘사슬 종료 방법’을 이용하여 하나의 단일 나선 DNA 주형, DNA 시발체(primer), DNA 중합효소, 보통의 디옥시뉴클레오시드3인산염 (dNTP)와 DNA 나선연장을 종료하는 디-디옥시뉴클레오시드3인산염(ddNTP)를 쟤료로 sequencing을 진행한다.
출처 : https://www.youtube.com/watch?v=593zWZNwbJI
사슬 종료 뉴클레오티드(ddNTP)는 인산이에스테르 결합 형성에 필요한 3′-[OH]가 없어, 삽입되었을 때 DNA 중합효소가 DNA의 연장을 중단하도록 한다. 일반적인 d(A,C,G,T)TP만 넣어주면 DNA 중합효소는 이에 상보적인 DNA를 합성하게 되지만 소량의 dd(A,C,G,T)TP를 섞어주게 된다면, DNA polymerase가 중간에 ddNTP가 끼어 들어간 DNA 분자를 합성되게 된다. 그러면 이러한 분자는 더 이상 길어지지 않고 합성이 중단된다.
출처 : https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-dideoxynucleotide
DNA 샘플은 네 가지 경우로 나누어 dATP, dGTP, dCTP, dTTP는 각 시험관에 모두 첨가하고, 디디옥시뉴클레오티드 (ddATP, ddGTP, ddCTP 또는 ddTTP)는 시험관 4개중 각 1개의 종류만 첨가시켜 DNA 중합효소로 중합시킨다. 시발체에서의 주형 DNA 연장이 여러 차례 이루어지면 생기는 DNA 조각은 열 변성되고 겔 전기 영동 과정을 통해 크기별로 분리된다. 이들 ddNTP에는 각각을 구별할 수 있게 형광물질이 결합되어 있어 새로이 합성된 DNA들의 마지막 염기 종류에 따라 서로 다른 형광을 띄게 된다. 합성된 DNA 분자들은 4개 중의 어느 하나의 ddNTP가 끼어 들어갔으므로 정확히 한 염기씩 길이의 차이가 나게 된다. 이들은 전기 영동법에 의해 크기 순으로 나열할 수 있으며, DNA 띠들은 방사능 촬영이나 UV로 형광물질에 따라 특이적인 파장의 빛을 발하게 되어 순서대로 읽으면 원래 염기서열과 상보적인 서열로 보이게 된다.
출처 : https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-dideoxynucleotide
Whole genome shotgun sequencing
출처 : https://www.slideshare.net/suryasaha/icar-ca-bin-delhi-bioinformatics
shotgun sequencing 기술은 원래 바이러스나 세균과 같은 작은 유전체 sequence를 알기 위해 사용되어졌으나 whole genome shotgun sequencing 기술이 등장하면서 크기가 크고 포유류의 전체 유전체를 서열화 하는데 응용되고있다. 이 기술은 긴 DNA 가닥을 sequencing 하는 방법으로 DNA sequence를 랜덤으로 깨서 작은 조각들을 많이 만들고 오버랩 되는 구역을 찾아서 전체 sequence를 읽어내는 방식이다. shotgun sequencing 기술은 원래 바이러스나 세균과 같은 작은 유전체 sequence를 알기 위해 사용되어졌으나 whole genome shotgun sequencing 기술이 등장하면서 크기가 크고 포유류의 전체 유전체를 서열화 하는데 응용되고있다. 이 기술은 긴 DNA 가닥을 sequencing 하는 방법으로 DNA sequence를 랜덤으로 깨서 작은 조각들을 많이 만들고 오버랩 되는 구역을 찾아서 전체 sequence를 읽어내는 방식이다.
Next Generation Sequencing(NGS)
차세대염기서열분석법 (Next-generation sequencing; Massive parallel sequencing)은 유전체를 무수히 많은 조각으로 나눈 뒤 각각의 염기서열을 조합하여 유전체를 해독하는 분석 방법으로, 2004년 최초로 상용화된 후 현재까지 그 성능이 발전해왔다. Next-generation sequencing (NGS) 또는 Second-generation sequencing로 잘 알려진 차세대 염기서열 분석법은 Massive parallel sequencing을 일컫는 말로, ‘대용량 염기서열 분석법’, ‘대규모 병렬형 염기서열 분석법’으로 번역된다. NGS 분석법은 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 얻은 데이터를 생물 정보학적 기법을 이용해 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하고자 한다. 차세대 염기서열 분석기법은 2007년 Roche가 처음으로 NGS 장비를 출시한 이후, lllumina Solexa(社), Applied Biosystems(社) 등이 연이어 NGS 장비를 소개하였다. 현재의 Sanger 염기서열 분석 장비는 기껏해야 동시에 수십 개의 전기영동이 가능한 반면, NGS 염기서열 분석 장비에서는 수십만 내지 수십억 개의 서로 다른 염기서열분석 반응이 동시에 진행되고 판독되어 유전체 분석에 소요되는 비용이 감소하고 있다. 장비마다 차이는 있으나 NGS 염기서열분석 과정은 검체 준비, 클론성 증폭, 염기서열분석의 3단계로 구성된다.
NGS 염기서열분석 과정
1) 검체 준비(sample preparation step)
검체는 분석 대상 (유전체 전체, 엑솜, 특정 염색체 부위, 특정 유전자 조합)에 따라 포획법, 분절법 또는 증폭법 등으로 준비된다. DNA 절편은 읽기 적절한 길이로 준비되고, 여기에 동시 증폭 및 염기서열반응을 위한 adaptor가 결합된다.
2) 클론성 증폭(clonal amplification step)
준비된 절편을 플레이트 위 일부 공간 또는 droplet(작은 물방울) 안에서 클론으로 증폭시킨다.
3) 염기서열분석(sequencing reaction step)
클론성 증폭이 이루어진 수십만 내지 수십억 개의 반응산물의 염기서열을 동시에 분석한다. 위 과정은 장비에 따라 1일~1주가 소요되며, 한 번의 분석과정에서 최대 600 Gb의 염기서열 정보를 얻을 수 있다. NGS는 대용량의 정보를 제공할 수 있으므로, 전체 유전체 외에도 특정 유전자 조합 또는 특정 염색체 부위의 염기서열정보를 얻는데 사용될 수 있다. 또한 minor allele을 동시에 분석할 수 있고, 상대적 정량도 가능하므로, 미생물이나 종양처럼 기원이 다른 핵산이 혼합된 경우의 정량적 분석에도 사용될 수 있다.
출처 : http://www.koreahealthlog.com/news/articleView.html?idxno=17862 NGS 데이터의 특징
NGS 데이터가 Sanger 염기서열분석 데이터와 다른 몇 가지 특징이 있는데, 첫 번째는 단일 가닥 염기서열분석(single strand sequencing)이다. Sanger 염기서열분석 데이터는 모든 세포의 DNA 염기서열의 총합으로 표현되는 반면, NGS 데이터는 각 세포에서 유래한 단일가닥 DNA 염기서열이 각각 독립적으로 표현된다. 바꿔 말해, NGS 데이터는 Sanger 데이터보다 polymerase error에 훨씬 취약하다는 약점이 있다. 따라서 NGS 데이터에서 특정 위치의 염기를 최소 몇 번 읽었는지(coverage depth), 염기변이의 빈도가 충분히 높은지가 중요하다. 두 번째, NGS는 대용량 데이터이다. 따라서 Sanger 데이터와 비교가 어려울 정도로 대용량의 정보를 얻을 수 있으나 분석 복잡도가 커서 빠른 속도의 분석 알고리즘이 필요하다.
세 번째, NGS의 기본 데이터 유형은 텍스트파일이다. Sanger에서는 전기영동을 통한 형광 종류별 강도 변화가 기록된 electropherogram이 주어지므로 텍스트 파일 외 각 peak 높이, peak간 간격, peak의 상대적 비율과 변화 등 다양한 정보를 통해 sequencing quality 및 분석소프트웨어의 분석 오류에 대한 직관적 파악이 가능하다. NGS도 장비에서 기록된 신호 데이터가 있지만, 매 사이클마다 한 번씩 형광으로 기록되고 sequencing quality에 대한 직관적 파악이 쉽지 않아 분석 소프트웨어의 분석 오류 발생 시 이를 파악하기가 어렵다. 이번 기사에서는 Sequencing의 역사와 차세대염기서열분석법, NGS에 대한 전반적인 준비과정과 데이터 특징들에 대해 알아보았다. 다음 기사에서는 NGS를 응용한 sequencing 방법들을 좀 더 자세히 이야기 하도록 하겠다.
sanger sequencing > BRIC
Q. sanger dna sequencing 질문 드립니다. sanger dna sequencing 실험을 하고 있는데요 ,, 앞부분과 끝부분을 잘 읽을 수 없어서 찾아보니까 신뢰할 수 없는부분 이니까 무시하라는 답변이 많네요 ,,, 이론적으로는 문제가 없어 보이는데 왜 앞부분과 … A. 있을까요?? : 자료를 잧아도 잘 안나올겁니다. DNA pol. 특징입니다. sequencing mixture의 반응이 시작하면 primer + 1번 염기부터 정확히 합성하지 못합니다. 적어도 10개 base정도 지나면 정확히 base를 넣어줍니다 … 답변 6 | 2020.11.18 Q. Sanger’s method DNA sequencing 에서primer에 형광물질을 붙일때 Sanger’s method DNA sequencing 에서 primer와 결합되는 template 가 신장될때 형광물질을 띠게 하기 위해 primer에 형광물질을 S35 나 P32 를 넣는데, 책을 읽어보니 dCTP나 dATP 를 넣는데, 이때 왜 CTP나 ATP를 … A. 종종 dATP대신 dCTP를 사용하기도 합니다만…… 혹자는 sequencing에 사용하던 klenow fragment에 dATP 반응성이 좋아서 그렇다는 말을 하던데 진위는 모르겠습니다 … 답변 1 | 2011.12.10 Q. sanger sequencing 단점 질문이요! 안녕하세요! sanger sequencing 관련해서 질문 드릴게 있는데 왜 sanger sequencing으롤 짧게 밖에 못읽히는거죠? 많은 수의 단편들을 읽을수 없어서 그런건가요?…. 그냥 생각에 기존보다 긴 폴리아크릴아마이드 … A. MiSeq 등의 NGS 장비에서 생산되는 평균 read length 에 비하면 sanger seq.의 길이가 더 길거나 긴 편입니다. 한편 sanger seq.은 ddNTP 를 사용해 시퀀싱 PCR을 수행 후 전기영동 하는 방식이기 때문에 최적의 … 답변 4 | 2016.03.09 Q. sanger sequencing검사에 쓰이는 primer 연구초보자입니다. Sanger sequencing을 진행할 예정이라서 그전에 primer를 찾고있습니다. 논문을 위주로 보고있는데요 nested PCR, multiplex PCR, Long range PCR에 쓰인 primer라던가 SSCP, HA, CSGE,DHPLC,PTT가 method인 … A. Sanger sequencing에 대한 이론적인 내용을 먼저 공부해 보세요. insert가 MCS에 들어있으면 universal primer, universal primer site가 없는 vector에 insert가 들어있으면 insert의 5′, 3′ primer나 5′, 3′ 상하류의 vector 서열을 … 답변 3 | 2020.03.04 Q. Sanger sequencing 실험 관련 문의 안녕하세요. Sanger sequencing 실험을 수행하려고 준비 중인 고등학생입니다. 실험에 필요한 장비 및 시약은 모두 있거나 구입 가능하나, sequence를 읽고자 하는 template DNA 및 primer의 sequence를 결정하는 데에 … A. – 가능하면 길게 읽는 것이 좋고 primer + 20bp 정도는 전기영동 band가 정확히 안나옵니다. 답변 5 | 2022.03.22 Q. sanger sequencing:) | 첨부파일 전통적 sanger sequencing 방법에서는 네 튜브에 각각의 dNTP를 처리하는데, 한 튜브에 두 종류의 dNTP를 처리했을때 첨부한 사진과 같은 결과값이 나온다면… ddATP 처리 튜브에서는 가장 아래의 band가 … A. ddATP + ddTTP tube의 반응이 잘 못된것 같습니다. ddATP 반응을 보면 염기서열이 AAA—–입니다. 따라서 ddTTP가 있다고 해서 첫번째 ddATP가 polymerization되지 않을 수는 없습니다. Q. 그러면 왜 ddTTP만 결합한 것인 … 답변 1 | 2018.10.15 Q. 화학하는 사람인데요 DNA sequencing (Sanger) 과 amplification에 질문있습니다. 주로 Sanger의 방법을 상용화시켜서 하고 있는 것으로 알고 … (random primer를 쓰나요?) 또 궁금한건 주로 DNA sequencing하려면 양이 얼마정도의 DNA (pmol? fmol?)가 필요하죠? 만일 그 DNA가 양이 굉장히 적지만 … A. Sanger Method에서 random primer는 사용할 수 없습니다. 1. Sanger Method의 핵심은 dideoxyterminator에 … 됩니다. 미지의 DNA를 Sequencing할때는 보통 Plasmid vector 등에 미지 DNA 단편을 클로닝하고, 이미 알고 있는 영역 … 답변 1 | 2007.11.30 Q. sequencing 에 대해.. 특히 NGS 이러한 DNA fragment 를 PCR 후에 sequencing 을 한 후, 이 정보를 모아 하나의 … 그렇다면 최초의 reference gene은 Sanger 기법으로 sequencing을 했겠죠?? 그럼 그 때는 어떻게 잘려진 DNA의 순서를 알 수 있었을까요? … A. 3. 제가 알기론 기존에 reference genome을 만들 때는 Sanger같은 전통적인 방식으로 라이브러리를 sequencing해서 나중에 assembly를 했던 걸로 알고 있습니다. 2nd generation NGS도 비슷한 개념인데 한가지 한계가 … 답변 2 | 2017.06.05 Q. sequencing 시 data가 깨끗하게 나오지 않아요 CoV-2의 spike protien을 Sanger sequencing을 통해 확인하고 있습니다. one step RT-PCR kit(HyQ One step RT-PCR kit)를 이용해 cDNA 합성과 PCR까지 한번에 진행하고 있고, 전기영동 상에서 band가 뜨는 것을 확인 후sequencing을 … A. – 네.. main band외에 위로 최소 2개 이상의 band가 보입니다. – 염기서열 분석을 깨끗하게, 최대한 길게 읽으려면 우선 target band외에는 아무 band가 없는 상태로 의뢰하는 것이 좋습니다. 답변 5 | 2022.08.04 Q. maxam-gilbert sequencing을 꼭 사용해야하는 경우(?) 실험(?)이 있나요? 어느 책에서.. 일반적으로는 sanger sequencing을 쓰지만 특정한 실험의 경우 maxam-gilbert sequencing을 쓴다고 하더라구요 ㅎㅎ 아직 세세하게 잘 알지 못해서 여기에 질문해봅니다 A. 아주 짧은 DNA 염기서열을 본다던가, mRNA의 n-terminal sequence를 번다던가, DNA에 protein이 붙는 위치를 찾는다던가….. 이럴때는 가끔 사용하기도 합니다. 답변 1 | 2016.10.24
Sanger sequencing
Sanger sequencing 기본원리 1977년 생거 등에 의해 개발된 염기서열 분석법으로서 1980년 생거가 두번째 노벨상을 받게된 계기다. 왼쪽 그림 상단에 나와있는 3′-ATGACTGAGC-5’와 같은 template DNA의 서열을 분석하는 경우에, 일반적인 d{A,C,G,T}TP (NTP)만 넣어주면 DNA polymerase는 이에 상보적인 DNA를 합성하게 된다. 하지만 dNTP 외에 소량의 dd{A,C,G,T}TP (ddNTP)를 섞어주게 되면, DNA polymerase가 template DNA에 상보적인 서열을 합성해 나가다가, 중간중간에 ddNTP가 끼어 들어간 DNA 분자가 합성되게 된다. 그러한 분자는 더 이상 길어지지 않고 합성이 중단되게 된다. 이들 ddNTP에는 각각을 구별할 수 있는 형광물질이 결합되어 있기에, 새로이 합성된 DNA 들의 마지막 염기 종류에 따라 서로 다른 형광을 띄게 된다. 여기에서 주목할 것은, 합성된 DNA 분자들은 모든 자리에서 4개 중의 어느 하나의 ddNTP가 끼어 들어간 것이기에, 정확히 한 염기씩 길이의 차이가 나는 것들이다. 이들은 전기영동법에 의해 크기 순으로 나열할 수 있으며, 레이저 빛을 각 전기영동 밴드에 쬐면, 형광물질에 따라 특이적인 파장의 빛을 발하게 되며, 이를 순서대로 읽으면 원래 염기서열과 상보적인 5′-TACTGACTCG-3’을 얻게 된다.
여기에서 다음 사항을 공부해 보세요. ddNTP는 dNTP와 화학적으로 어떻게 달라서 위 그림에서와 같이 chain-terminating 반응을 할 수 있는가?
ddNTP와 dNTP는 어는 정도의 비율로 섞어 줘야 할까?
원래 생거시퀀싱이 개발될 때는 형광물질이 아닌 燐 방사성 동위원소의 방사선을 X-선 필름에 감광하였다. 이때는 A,T,G,C를 어떻게 구별했을까?
DNA polymerase가 상보적인 염기를 합성하려면, 소위 primer라는 DNA 조각이 결합된 이중나선 부위가 존재하여야 그 뒤의 단일가닥 부위에 상보적인 합성이 가능하다 (참고 그림). 우리가 시퀀싱하고자 하는 DNA는 일반적으로 그 서열을 모르는데, 어떻게 primer를 합성하여 반응에 사용할 수 있을까?
생거 시퀀싱에 대해 더 자세한 정보를 원하면 다음 사이트를 공부해 보세요. 위키피디아: Sanger sequencing 미국 인간게놈연구소 교육사이트 온라인 애니메이션: How to Sequence a Genome (YouTube Chapter 6-10)
Base call quality score 전기영동으로 다양한 크기의 DNA 분자를 분리하는 방법은, DNA 분자에 있는 인산결합이 음전하를 띄고 있기에 아래쪽에 양극을 배치하여 전기적으로 당기게 된다. 일반적으로 수 시간이 걸리게 되는데, 처음에는 크기에 따라 잘 구별되던 DNA 분자들이 시간이 경과하면서 확산 작용에 의해 번지게 된다. 따라서, 늦게 나오는 전기영동 밴드는 더 넓게 퍼진 상태가 되며, 심해지면 이웃 밴드와 겹치게 되어 분해능이 떨어지게 된다. 오른쪽의 일반적인 전기영동 크로마토그램을 보면 이와 같은 현상을 볼 수 있다. 이런 전기영동 크로마토그램을 분석하여 염기서열을 결정짓는 소프트웨어들은 각 위치별로 염기 서열 분석 결과의 신뢰도를 에러율의 형태로 출력한다. 즉, “T”라고 판정했으면, “그것이 틀린 확률은 1%임”이라고 보고하는 것이다. 일반적으로 에러율이 1% 넘는 염기들이 연속적으로 나오면, 그 뒷부분의 서열은 모두 도려낸다. 생거 시퀀싱은 한번에 통상 500 염기 정도의 양질의 서열을 얻을 수 있는 것으로 알려져 있다.
여기에서 다음 사항을 공부해 보세요. 시퀀싱 크로마토그램의 뒷 부분뿐이 아니라, 앞부분도 봉우리가 깔끔하지 않다. 이 부분도 뒷부분과 마찬가지 방법으로 제거하는 것이 좋을까?
염기 서열 분석의 정확도는 에러율의 형태로 나타내다보니까 0~1의 작은 수이기에 사용에 불편할 때가 많다. Phred라는 염기서열분석 소프트웨어는 자체적으로 변화한 값을 출력하는데, 이를 통상 phred score라고 부른다. 에러율에 상용로그를 취하고 -10을 곱한 수이다. 즉, 에러율이 1%라면 phred score는 20이 된다. 만약에 에러율이 0.1%면 phred score는 얼마인가? 또한 phred score가 40이라면 이는 에러율 얼마에 해당하는가?
2. Sanger sequencing의 기본원리
Sanger sequecing
1977년 생거 등에 의해 개발된 염기서열 분석법
1980년 생거가 2번째 노벨상을 받게 됨
일반적인 template DNA의 염기서열 분석
3′-ATGACTGAGC-5’와 같은 template DNA 서열 분석에서는
d{A,C,G,T}TP (dNTP)만 넣어주면 DNA polymerase는 이에 상보적인 DNA를 합성하게 된다
DNA polymerase가 상보적인 염기를 합성하려면, 소위 primer라는 DNA 조각이 결합된 이중나선 부위가 존재하여야 그 뒤의 단일가닥 부위에 상보적인 합성이 가능하다 (참고 그림). 우리가 시퀀싱하고자 하는 DNA는 일반적으로 그 서열을 모르는데, 어떻게 primer를 합성하여 반응에 사용할 수 있을까?
Single stranded ( 5말단 -> 3말단 )가 있다고 가정하고, T C A A C G – 순으로 염기서열이 있다고 가정하자.
4배수 Primer (프라이머)를 연구자가 미리 넣어주면, 5말단->3말단순으로 (A-G-T-C에 대해) T-C-A-G 상보적으로 결합되면서, 해당 부분이 Double stranded 가 된다.
( 5말단 -> 3말단 )가 있다고 가정하고, T C A A C G – 순으로 염기서열이 있다고 가정하자. 4배수 (프라이머)를 연구자가 미리 넣어주면, 5말단->3말단순으로 (A-G-T-C에 대해) T-C-A-G 상보적으로 결합되면서, 해당 가 된다. 이 때, DNA 폴리머라아제는 나머지 Single Stranded 부분을 -> Double Stranded가 되도록 리액션 하게 된다.
여기에 필요한 것이 dATP, dTTP, dCTP, dGTP이며, 이것을 따로 넣어줘야한다.
– (T에 대해) dATP를 잘라서 A를 붙히고 , (A에 대해) dTTP를 잘라서 T를 붙히고… 이런식으로 Single-stranded를 메꾸도록 한다.
Sanger Sequencing 기본 원리
dNTP + 소량의 dd{A,C,G,T}TP ( ddNTP )를 섞어주게 되면, DNA polymerase가 template DNA에 상보적인 서열을 합성해 나가다가, 중간중간에 ddNTP가 끼어 들어간 DNA 분자가 합성되게 된다. 그러한 분자는 더 이상 길어지지 않고 합성이 중단되게 된다. 이들 ddNTP에는 각각을 구별할 수 있는 형광물질이 결합되어 있기에, 새로이 합성된 DNA 들의 마지막 염기 종류에 따라 서로 다른 형광을 띄게 된다. 여기에서 주목할 것은, 합성된 DNA 분자들은 모든 자리에서 4개 중의 어느 하나의 ddNTP가 끼어 들어간 것이기에, 정확히 한 염기씩 길이의 차이가 나는 것들이다. 이들은 전기영동법에 의해 크기 순으로 나열할 수 있으며, 레이저 빛을 각 전기영동 밴드에 쬐면, 형광물질에 따라 특이적인 파장의 빛을 발하게 되며, 이를 순서대로 읽으면 원래 염기서열(3′-ATGACTGAGC-5′)과 상보적인 5′-TACTGACTCG-3’을 얻게 된다.
DNA polymerase가 상보염기를 형성해 나가다가 ddNTP 4개 중 하나인 ddT TP 가 섞여 들어가게 되면, 합성을 멈추게 된다 .
정상적인 dT TP가 들어올 때는 합성이 진행하다가 ddT가 합성되어버릴 경우 끝에 ddT로 멈추게 된다 .
가 섞여 들어가게 되면, . 정상적인 TP가 들어올 때는 합성이 진행하다가 ddT가 합성되어버릴 경우 . 이 때, 멈추게 되는 간격은 정확히 한 염기의 길이 씩 차이가 날 수밖에 없다.
씩 차이가 날 수밖에 없다. 종류는 3′-ATGACTGAGC-5′ 에 대해서 총 10가지이다. size는 모두 제각각의 unique한 size를 갖는다.(끝나는 자리가 T,A,C,G 모두 다르므로)
– T로 멈추는 경우 3 ( 1bp, 4bp, 8bp)
– A로 멈추는 경우 2 ( 2bp, 6bp)
– C로 멈추는 경우 3 ( 3bp, 7bp, 9bp)
– G로 멈추는 경우 2 ( 5bp, 10bp)
– T로 멈추는 경우 3 ( 1bp, 4bp, 8bp) – A로 멈추는 경우 2 ( 2bp, 6bp) – C로 멈추는 경우 3 ( 3bp, 7bp, 9bp) – G로 멈추는 경우 2 ( 5bp, 10bp) 이 10가지를 한 well-plates에 넣은 다음(모두 음전하를 띄고있음), 전기영동으로 (양전하로 땡겨주면) 양전하쪽으로 이동시킨다.
– 제일 가벼운 1bp가 가장 가까이 이동하고 size대로 순서대로 거리를 이루게 된다.
– 제일 가벼운 1bp가 가장 가까이 이동하고 size대로 순서대로 거리를 이루게 된다. 이 때, ddT, ddA, ddG, ddC는 서로 다른 형광물질을 입혀넣았기 때문에, T로 끝나는 것들은 서로 같게 된다. 4가지 서로 다른 색을 가진다.
여기에 Photomultiplier로 불빛을 켜서 비추면, 가장 가까운 곳에 1bp의 T가 보일 것이다.
– 1배수 T(1bp – 빨간색), 2배수 A(2bp – 보라색) 등등으로 sequencing이 이루어진다.
ddNTP와 dNTP의 차이(과제)
ddNTP와 dNTP의 차이는 무엇인지. 왜 ddNTP 는 합성을 멈추는 chain-terminating 반응을 하는지 에 대해서 알아보자.
는 에 대해서 알아보자. ddNTP는 어느 정도를 섞어줘야할지 비율도 알아보자.
생거는 형광물질을 사용하지 않았다고 한다. 방사선 동위원소를 이용하여, 전기영동하면 나타나는 방사선을 X-선 필름에 감광시켜 위치를 알아냈다. 하지만 4가지 모두 동일한 방사선을 나타내기 때문에 어떻게 이것을 구분했을까?
Primer가 있어야 DNA sequencing이 가능한데, 우리가 sequencing하고 싶은 Single-stranded DNA는 순서를 모르니까 sequencing 하는 것인데 Primer를 어떻게 구성할지도 난감하다.
미국 인간게놈 연구소에서 만든 애니메이션 – How to Sequence a Genome – part 6, 7, 8, 9 (강추!)
https://www.genome.gov/25019885/
https://www.genome.gov/edkit/flash/section6.html
https://www.genome.gov/edkit/flash/section7.html
https://www.genome.gov/edkit/flash/section8.html
https://www.genome.gov/edkit/flash/section9.html
2001년 논문으로 publishing된 인간게놈 프로젝트 in Nature , 동시에 교육자료도 제공했음.
Part 6
Part 7
– 한 base pair씩 차이나는 DNA 분자가 얻어지고 종류에 따라 다른 색의 DNA들이 500-800base 정도가 얻어진다.
– 얻어진 products들은 위와 같은 자동화 기기에 삽입된다.
– 한 base pair씩 차이나는 DNA 분자가 얻어지고 종류에 따라 다른 색의 DNA들이 500-800base 정도가 얻어진다. – 얻어진 products들은 위와 같은 자동화 기기에 삽입된다. Part 8
– 전기영동으로 분리되는 과정이다.
– DNA들은 (-)전하를 띄고 있기 때문에, 전기영동 장치의 하단에 있는 (+)전하로 짧은 순으로 끌려간다.
– 전기영동으로 분리되는 과정이다. – DNA들은 (-)전하를 띄고 있기 때문에, 전기영동 장치의 하단에 있는 (+)전하로 짧은 순으로 끌려간다. Part 9
– (+)전하쪽으로 빠져나올 때, Laser를 쏘면, 각 종류별 형광물질이 나오게 되면서, 기본적인 Sanger Sequencing이 완성된다.
– 연속적으로 500번 ~ 800번의 전기영동을 통해서 최종적으로는 시퀀싱기계에 기록되어, 인간의 Single sequncing이 reveal된다.
– 아래는 560번 정도의 생거 시퀀싱 결과의 크로마토그램
– 각 자리별로 가장 높은 것이 명확하게 들어나고, 색도 명확하다(검은색 G, 초록색 A..) 이 하나하나가 DNA 분자이다.
– 가장 앞과, 가장 나중에 뭉개지고 색이 겹쳐지는 경향이 있긴하다.
Base call quality score
위의 560base 전기영동 결과 중 색이나 peark가 겹친 부분이 있다. 이것을 확률적으로 나타내는 것을 base call quality score라고 한다.
예를 들어, T라고 얘기했는데, error율도 같이 이야기 해주는 것이다.
1% 이상의 error가 연속적으로 나타난다면 잘라내서 버리는 작업을 Trimming이라고 하며, 생거 시퀀싱을 한번 할 경우 560base 중 500base 정도가 남는다고 한다.
뭉개지는 앞부분도 제거를 해야할까?
1%이하의 에러율이 너무 작은 수로 표시되므로, Phred 라는 염기서열분석 소트트웨어 를 통해 자체적으로 변환시킨 값인 phred score 를 출력하게 되는데,
Phred score : [ 에러율 ] 에 로그를 취한 뒤 -10을 곱한 것
– 1% error : ( 0.01 -> Log ( ) -> -2 * -10 = 20 phred score
– 0.1% error : ? phred score 30
– ? error : 40 phred score ( -10^-4 )
를 통해 자체적으로 변환시킨 값인 를 출력하게 되는데, – 1% error : ( 0.01 -> -> -2 = 20 phred score – 0.1% error : ? phred score – ? error : 40 phred score ( ) my) 1% = 0.01 -> 20 / 0.1% -> 0.001 -> 30 / 0.01% -> 0.0001 -> 40
생각하기
생거 시퀀싱은 자동화가 되므로, 처음에는 agarose gel plate에다가 여러 개의 샘플을 동시에 전기영동 분리 하였다. ( plate 당 32개 정도)
이후에는 모세관을 이용한 capillary 전기영동을 함. 96개의 유리관을 사용. ( 유리관 1개당 1 sample)
– 이러한 과정을 로버트 팔을 이용해서 자동화 하였음.(ABI 37000)
– 하루에 10개 plate를 시퀀싱하였으니 10 * 96 well(유리관) -> 10 * 384 well( 유리관) 개의 DNA sequencing 개의 sample
– sample당 500 염기씩 읽음.
– 500(DNA) * 384 well(sample) * 10 (하루당) 개의 염기 시퀀싱
– 인간의 30억개 염기 –> 1번 읽는데 3000일 소요, / 평균 10번 읽어야하므로 30000일 소요
– 기계 100대를 동시에 –> 300일 소요
Sanger Sequencing and Fragment Analysis by CE
Sanger sequencing is used to study a small subset of genes linked to a defined phenotype, confirm next-generation sequencing (NGS) variants, detect minor allele fractions down to 5%, or read contiguous sequences up to 1,000 bases.
Fragment analysis is a powerful technique with simple, straightforward workflows and used in a wide-range of applications, such as detection of mutations, genotyping, identification of short tandem repeats, and gene expression profiling.
Applied Biosystems genetic analysis systems are a trusted standard for Sanger sequencing and fragment analysis by capillary electrophoresis—proven through decades of results, including the first sequencing of the human genome and the discovery of genes implicated in diseases like cystic fibrosis.
Explore applications, instrumentation, reagents, consumables, and software designed to respond to the unlimited potential of scientific inquiry.
키워드에 대한 정보 생어 시퀀싱
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